一、研究背景

近几十年来，电纺丝的使用迅速增加，因为静电纺丝装置是一种简单、经济、多功能的纤维支架制造方法，可广泛应用于一系列领域，包括但不限于组织工程、伤口敷料、药物输送、传感器、卫生系统和过滤。由于电纺纤维支架具有高表面积-体积比，能够模拟宿主组织的细胞外基质（ECM）并支持细胞附着和生长，因此在组织工程领域被广泛研究。因此，电纺丝已被用于模拟各种不同的人体组织，包括骨骼、心脏、皮肤和眼部。然而，电纺纤维在某些组织工程应用中的作用可能会受到限制，因为密集的纤维网和较小的孔径会阻碍细胞进入该结构，从而使这些支架无法真正模仿宿主组织并促进其原生细胞的活性。这往往导致电纺支架被视为二维（2D）或 2.5D 结构，而不是三维（3D）结构。

更好地控制孔径可以更准确地模拟天然组织的间距，从而使细胞与这些合成支架的相互作用达到更理想的效果。众所周知，改变聚合物溶液的特性（如粘度、挥发性、导电性）和电纺丝参数（如外加电压、流速）会直接影响最终纤维直径和纤维间距（即孔径）。其他方法包括牺牲纤维和微粒纺丝。前者是将两种聚合物并行电纺丝，形成双纤维支架，然后将其中一种聚合物溶解在溶液（如水中的聚环氧乙烷）中，只留下一种聚合物纤维。后者的方法与前者非常相似，但牺牲成分同时进行电喷雾，将水溶性微颗粒（如聚环氧乙烷）加入纤维中，然后再将其洗出。这两种牺牲技术都能成功制造出纤维间距更大的纤维支架，但需要额外的设备安装和材料成本。

据报道，湿电纺也是增加孔径的一种可行方法。在这里，电纺纤维穿透液体凝固浴，悬浮在液体中，形成多孔的三维结构。这种技术虽然具有优势，但需要垂直电纺丝装置，可能并不适合所有系统。另一种增加孔径和整体孔隙率的方法是低温电纺丝（cryo-spinning）[24]，这种方法不依赖于设备方向，只需要相关聚合物即可。这种技术利用装有干冰的收集系统，在纤维收集过程中形成冰晶，使纤维间距更远，升华后纤维间距仍保持不变（图 1）。

冷冻纺丝纤维支架已被研究和开发用于模拟多种不同的组织，包括血管、肾脏和软骨。小梁网（TM）是另一种适合低温纺丝的组织。小梁网是位于眼球前段的多孔组织，负责调节房水的流出，进而调节眼压。该组织由混乱排列的胶原束组成，形成复杂的孔隙结构，直径在 8.3 到 12.8 微米之间，整体孔隙率为 85.0 ± 1.0% 。文献表明，TM 细胞直接受其生长的孔隙大小的影响，当体外培养在较大的孔隙上时，TM 细胞的增殖和纤维粘连蛋白的沉积量都会增加。

在本研究中，聚ε-己内酯（PCL）被选为示范聚合物，因为它具有生物相容性、生物可降解性，而且易于调整电纺参数以创建各种纤维支架，因此常用于组织工程应用。在此，我们旨在确定低温电纺支架与传统电纺支架相比，在结构和机械性能以及支持小梁网细胞浸润的能力方面，作为小梁网的模拟物是否有用。我们假设低温纺丝 PCL 将制造出一种高多孔电纺支架，与传统电纺 PCL 相比，它能更好地模拟小梁网的结构，并支持更大的小梁细胞浸润。

二、摘要

人体小梁网是一种具有大孔的筛状组织，在房水外流过程中起着至关重要的作用。该组织的功能障碍可导致青光眼和永久性视力丧失。用组织工程装置替代小梁网是最终目标。本研究旨在利用电纺丝技术制造小梁网的生物仿生结构。传统电纺丝与低温电纺丝进行了比较，后者是对传统电纺丝的改良，在纤维收集系统中加入了干冰。干冰会在纤维之间形成冰晶，增大纤维间距，并在升华后保留下来。结构特性分析表明，低温支架在孔隙大小、孔隙率和厚度方面更接近小梁网。健康的人类小梁网细胞系（NTM5）在支架上的附着不受制造方法的影响。主要目的是评估细胞浸润情况。冷冻支架支持细胞在七天后渗入其结构深处，而传统支架的细胞则停留在外层表面。这项研究表明，低温电纺丝适用于近似再现小梁网，具有作为三维体外模型和组织工程设备的潜力。

三、结论

我们评估了孔径和孔隙率对细胞浸润电纺纤维支架的影响。在保持所有其他参数不变的情况下，只需改变电纺过程中的纤维收集方法，就能制造出不同孔径和孔隙率的支架。在收集芯轴内加入干冰可促进冰晶的形成，从而产生更大的纤维间距，并在升华后得以保留。与传统的 PCL 纤维支架相比，增加的孔径、孔隙率和支架整体厚度都更接近模拟人体小梁网的结构。此外，这些低温 PCL 支架还支持健康的人类小梁网细胞系的附着和浸润，其厚度达到支架总厚度的 62.31 ± 10.21%。

这项研究证明了低温电纺支架作为小梁网模拟物的实用性及其作为三维体外模型的潜在应用，以支持对这种组织及其在青光眼研究中的作用的进一步研究。

图1.电纺丝和低温电纺丝工艺。(A) 传统电纺丝和 (B) 低温电纺丝装置示意图。

 

图2.低温电纺增加了纤维间距，但不影响形态或直径。(A) 电纺聚(ε-己内酯)（PCL）和低温电纺 PCL（cryo-PCL）的扫描电子显微照片（放大率 ×10,000，比例尺 = 5 µm）。(B) 纤维直径显示为小提琴图，显示 PCL 和低温电纺 PCL 的纤维直径分布、中位数和四分位数间距（n = 100）。双尾 Mann-Whitney 统计检验（P < 0.05），非显著性用 ns 表示。(C) PCL 和低温 PCL 的共聚焦单切片图像（厚度 1.46 µm）（橙色 = 罗丹明染色纤维）（物镜 20×，比例尺 = 10 µm）。

 

图3.低温电纺增加了电纺 PCL 支架的孔径和厚度。电纺聚ε-己内酯（PCL）和低温电纺 PCL（cryo-PCL）在（A）正面和（B）横截面方向上的 X 射线计算机断层扫描图像（比例尺 = 100 µm）。

 

图4.NTM5 细胞在电纺聚ε-己内酯（PCL）支架和低温电纺 PCL（cryo-PCL）上培养 7 天后的 Z 叠共聚焦图像。细胞核（DAPI，蓝色）、细胞骨架（phalloidin-488，绿色）和纤维（罗丹明，橙色）的免疫细胞化学染色。所示图像： XY z-stack （20 倍物镜，比例尺 = 50 µm）、XZ 和 YZ 侧视图。XY z-stack 上的白色虚线代表 XZ（水平）和 YZ（垂直）图像的位置。