一、研究背景

细胞转染是一种引入外来物质（如核酸、蛋白质、小药物和探针）以产生基因刺激或修饰细胞的过程。它的应用包括基因编辑、过继免疫治疗、再生医学和药物发现。病毒法和非病毒法都是细胞转染的常用方法在非病毒方法中，以脂质体为基础的化学方法是最受欢迎的。然而，它相对缓慢，效率低下，并且难以靶向特定细胞，因为货物是通过内吞作用在细胞内传递，然后是内体逃逸。物理转染方法直接在细胞膜上形成足够大的孔，以促进细胞外物质进入细胞的运输。可以使用各种物理刺激，如电（电穿孔）、声波（声穿孔）、激光（光穿孔）等。

大量电穿孔（BEP）作为一种简便的物理转染方法，已经商业化了几十年。在BEP中，电池随机分布在两个平行电极之间的散装货物溶液中。由于电场分布在每个细胞周围，为了成功的穿孔和货物运输，细胞膜的很大一部分不可避免地被破坏然而，BEP的主要缺点是药物剂量不可控，细胞间差异大。尽管电场在散装溶液中相对均匀，但电池通常没有均匀的尺寸。由于细胞半径不同的跨膜电位尺度，大细胞受到的损伤更强烈，而小细胞可能无法成功穿透，导致剂量变化较大。此外，为了达到高剂量，需要更强烈的膜穿孔，这不可避免地损害了细胞的活力。

为了实现高细胞活力、剂量均匀性和转染效率的转染，近几十年来开发了局部微/纳米电穿孔（MEP/NEP）平台。在MEP/NEP中，微/纳米通道用于调整电场分布。细胞紧靠微/纳米通道，电场局部聚焦于附着在微/纳米通道上的细胞膜的一小部分。核酸货物通过电泳通过微/纳米通道进入细胞。然而，大多数不面向纳米通道的细胞膜受到的干扰最小，从而导致细胞存活率高。此外，MEP/NEP大多可以与不同的细胞操作技术相结合，以实现单细胞水平的电穿孔和多细胞电穿孔，具有高转染均匀性和剂量控制。这种具有微/纳米通道的受限几何形状在生物分子和细胞的分选、分离和凝聚中也很常见。

转染电压是定义转染窗口最广泛使用的参数之一，它直接影响决定细胞膜穿孔的跨膜电位。之前的一些研究揭示了NEP/MEP系统中形成电孔和输送不同尺寸货物的最小电压（或阈值电压）。然而，对NEP/MEP中使用的最大电压的研究很少。随着转染电压的增加，细胞膜的损伤也会越来越严重，导致细胞活力降低同时，电场、焦耳加热和电动流动之间的耦合也不能再忽略。首先，由于受限通道中较高的局部电场强度，焦耳加热成为一个问题。升高的温度可以改变材料的特性，如缓冲液的导电性、渗透率和粘度，从而影响电场强度本身。其次，热诱导对流还与电渗透（EO）和电泳（EP）流动积极相互作用，显著影响微/纳米流体装置中的货物运输。此外，过度加热很容易导致细胞裂解和死亡。此外，由于液体蒸发而形成的气泡会降低货物运输的转染效率。此外，强烈的焦耳加热有时会损坏器件并影响器件的可靠性。在以往的研究中，焦耳加热对BEP的影响进行了全面的研究。然而，在NEP/MEP中并没有得到很好的理解。

在这项工作中，我们开发了一种微流控生物芯片，采用简单的制造路线，在单细胞水平上研究焦耳加热、EO和EP对不同通道尺寸的MEP/NEP的影响。我们揭示气泡形成的阈值电压由于过热的流体。由于EO的作用，气泡被推到货物侧，并附着在纳米通道的出口上。在通道内的高电场下，高EO速度和气泡的形成都会降低货物的运输效率，特别是对于电泳迁移率低的质粒dna （3.5 kbp）。根据本研究中使用的特定条件，我们定义了一个基于NEP/MEP的具有不同大小通道的“电穿孔区”。保证货物运输效率有两个标准。首先，焦耳加热不能太剧烈，以免造成缓冲溶液过热，这样可以防止通道内形成气泡。其次，近地速度不会压倒近地速度，从而导致货物向相反方向运输。这一基本原理可用于选择和设计NEP/MEP系统，以交付不同尺寸的货物。

二、摘要

局部微/纳米电穿孔技术（MEP/NEP）具有细胞活力高、剂量控制精确、转染效果好等优点，在细胞转染方面具有巨大的潜力。在MEP/NEP中，微通道或纳米通道用于调整电场分布。通过微米或纳米通道将细胞紧密定位，并通过电泳（EP）将货物通过通道输送到细胞中。这种具有微纳米通道的受限几何结构也广泛应用于生物分子和细胞的分选、分离和凝聚。在这些应用中，对电动力学现象的理论研究已经很好地建立起来。然而，在MEP/NEP应用中，电动力学现象及其对细胞转染效率和细胞存活率的影响尚未得到全面研究。在这项工作中，我们揭示了在不同通道尺寸的MEP/NEP中电场，焦耳加热，电渗透（EO）和EP之间的耦合。利用微流控生物芯片在单细胞水平上研究MEP/NEP的电动力学现象。由于焦耳加热，在阈值电压下观察到气泡的形成。气泡被推到货物侧，在纳米通道出口处生长。随着电压的增加，由于更强的极电迁移，特别是对于具有低极电迁移率的质粒dna (3.5 kbp)，货物运输效率降低。为不同通道大小的NEP/MEP系统定义了一个“电穿孔区”，以避免气泡形成和过快的EO速度，从而降低货物运输效率。

三、结论

我们在单细胞水平上进行了实验和数值分析相结合的方法来研究NEP/MEP过程中的电动力学现象。结果表明，当温度高于纳米通道内的沸点时，由于焦耳加热导致缓冲溶液蒸发，导致气泡形成的阈值电压和货物输送效率降低。气泡通过EO和对流两种方式被输送到纳米通道的出口。气泡变大并附着在纳米通道的出口处。随着电压的升高，气泡的形成和强烈的散装流都会导致货物运输效率的降低。特别是对于大型货物，如质粒dna (3.5 kbp)，电泳（EP）迁移率低，EO速度甚至可以高于EP速度。基于本研究中使用的特定条件（单个10 ms平方脉冲递送~ 3.5 kbp质粒dna），我们为具有不同大小通道的NEP/MEP定义了一个“电穿孔区”。在实验和数值分析的基础上，我们提出了两个准则，以尽量减少电动力现象的负面影响。首先，焦耳加热不要太剧烈，以免造成缓冲液过热，这样可以防止通道内部形成气泡。其次，EP速度高于EO速度，使货物的运输方向始终朝向单元。最后，提出了避免设备过热和强烈逆流的设计规则，以实现高效的NEP/MEP。

图1.10脉冲NEP期间焦耳加热测量(10毫秒脉冲持续时间；脉冲频率10hz，总持续时间1s)。(a)温度与rhb标记细胞荧光强度的相关性。荧光强度随温度升高而降低。(b)细胞平均荧光强度（蓝色曲线）和平均温度（红色曲线）振荡。温度变化在每次电脉冲开/关之间被捕获。(c)每个脉冲期间和之后由荧光图像转换的细胞伪温度图像。在纳米通道附近观察到电池的强烈局部加热，最高温度约为80°C。每次脉冲后，整个电池的温度迅速降低。在下一次脉冲之前，细胞温度下降到接近室温。

图2.新经济政策/环境经济政策中的热和电动力现象示意图。(1)转染电压过低导致细胞膜不能有效穿孔。几乎没有货物进入细胞。焦耳加热和EO都不重要。(2)转染电压高到足以穿透细胞膜。即使有一些EO散装流量，货物也可以被输送到电池中。(3)由于转染电压升高和局部过热，小通道内形成气泡。小气泡被输送出通道，并在纳米通道出口处合并成一个大气泡。然而，流体仍然是连续的，这使得货物运输进入细胞，同时损害了运输效率。(4)由于电压远远超过气泡形成的阈值电压，一个大的气泡阻塞了整个通道。由于水动力的作用，细胞与纳米通道的出口分离。流体变得不连续，并且没有货物运输。