一、研究背景

静电纺丝是一种通过在针状喷嘴内对聚合物溶液施加高压静电力来制造纳米纤维的技术。纳米纤维的物理性质可以通过改变聚合物、溶剂和溶液流速等参数以及施加电压来调节。静电纺丝的特点是由于纳米纤维的高表面积使其溶剂蒸发迅速，从而使其能够在室温下制造。这种能力使其在组织工程、再生医学、制备伤口敷料和合成药物制剂等方面具有广阔的应用前景。一般来说，静电纺丝包括对溶液施加10至40千伏的高压，但电流在微安范围内非常低；因此，能源消耗也很低。这一过程在室温下进行，适用于不稳定的生物分子，尽管在生产率方面存在挑战，但对基于核酸的药物是有利的。

将核酸（如siRNA和mRNA）掺入纳米纤维支架中模拟细胞外基质对于组织和干细胞工程至关重要。包裹在纳米纤维支架内的sirna作为控释储存库，提供潜在的长期基因治疗效果，并指导和支持种子细胞。为此，在细胞培养基中不容易溶解的疏水聚合物，如聚己内酯或聚（丙交酯-共聚物），常被用作基质。

静电纺丝生产的聚合物纳米纤维适用于透皮治疗系统和制造伤口敷料。此外，已有大量报道表明，它们可通过口服给药、粘膜疫苗用于舌下应用以及粘膜组织（如眼睛、肺和阴道）的局部药物治疗，在胃肠道中进行部位特异性药物释放。展望了将核酸药物掺入聚合物基纳米纤维的发展前景。静电纺丝作为一种室温工艺，是一种有前途的替代冷冻干燥固化核酸药物的方法。在纳米纤维直接应用于患者的情况下，更有可能选择最终溶解或降解的高水溶性聚合物。

本研究使用水溶性聚乙烯醇（PVA）作为药物制剂中普遍使用的赋形剂，作为纳米纤维包封sirna（一类核酸疗法）的基础基质。最近的报道已经证明了聚乙烯醇纳米纤维在药物传递应用中的优点，强调了它们在控释和生物相容性方面的潜力。

PVA的物理特性主要包括它的水溶性，它的水解度（羟基与乙酰基的比例）和聚合度（单体数量）决定了它的水解度。PVA等级的选择允许量身定制的亲水性，使PVA纳米纤维成为核酸药物控制释放的有力候选物。通过交联，PVA可以变得不溶性，这是制备伤口敷料时利用的一种特性。此外，不适合静电纺丝成纳米纤维的材料，如羧甲基纤维素，可以通过与聚乙烯醇杂交而被改造成纳米纤维。将聚乙烯醇与各种功能聚合物相结合的混合纳米纤维的许多应用已经被记录在案。例如，具有粘膜粘附和胃潴留特性的结冷胶/PVA纳米纤维，用于伤口愈合的明胶/PVA纳米纤维，以及用于透皮给药系统的壳聚糖/PVA和聚乙烯吡咯烷酮/PVA纳米纤维已被开发出来。因此，综合分析核酸药物的包封效率及其细胞摄取效率与不同等级PVA的关系是必要的，以最佳地利用PVA基纳米纤维作为传递核酸药物配方的通用平台。

在基于纳米纤维的核酸药物配方中，阳离子脂质或替代转染剂的整合是必不可少的。通常，带正电荷的核酸药物形成的配合物与带负电荷的细胞膜进行静电相互作用，促进其吸附。随后，这些复合物通过内吞作用被细胞内化，这对药物的功能至关重要。

本研究旨在利用静电纺丝设备制备siRNA负载的纳米纤维，并以siRNA为核酸治疗剂。siRNA转染选择1,2-二酰-3-三甲基丙烷（DOTAP），一种带有季铵基团的阳离子脂质。我们的方法是通过静电纺丝将DOTAP/siRNA复合物嵌入PVA纳米纤维中。水解度88%，聚合度高的PVA (GOHSENOL™EG-40P)，常用的药用赋形剂作为标准品。我们首先用EG-40P制备了DOTAP/ sirna包封的PVA纳米纤维，对制备方法进行了优化。利用EG-40P纳米纤维，研究了不同制备方法对siRNA细胞内分布和RNA干扰（RNAi）效果的影响。这项评价是在A549-Luc细胞上进行的，该细胞来源于人类非小细胞肺癌，具有稳定的荧光素酶表达。此外，还探讨了不同PVA等级（以聚合和皂化程度区分）对siRNA抑制荧光素酶活性的影响。

二、摘要

本研究旨在开发聚乙烯醇（PVA）纳米纤维，通过静电纺丝封装1,2-二酰-3-三甲基丙烷(DOTAP)/siRNA复合物，用于递送核酸类药物。重点研究了聚乙烯醇的内在特性对体系效能的影响。制备了直径为300-400 nm的PVA纳米纤维，siRNA保持完整，DOTAP/siRNA复合物均匀分散。通过将DOTAP/siRNA复合物掺入PVA纳米纤维中，并评估其RNA干扰（RNAi）活性对A549-Luc细胞的影响，观察到对荧光素酶表达的稳定抑制。对纳米纤维制备过程的研究表明，即使将DOTAP或siRNA分别添加到PVA溶液中，而不形成复合物，RNAi效应仍然存在。PVA纳米纤维释放的DOTAP/siRNA复合物被细胞内化，一些PVA残留物残留在其表面。强调了聚乙烯醇水解度和聚合度对纳米纤维性能的影响。值得注意的是，低水解度的PVA显著增强了RNAi效应，荧光素酶表达抑制率达到91.5±0.7%。通过阴离子或阳离子修饰的PVA级纳米纤维也被评估，表明它们影响siRNA递送的功效。所获得的见解为进一步优化药物输送系统的未来研究提供了途径。

三、结论

本研究旨在通过在PVA纳米纤维内包封DOTAP/siRNA复合物，开发一种利用静电纺PVA纳米纤维的核酸药物递送系统，并阐明siRNA包封纳米纤维的特性，包括其RNAi活性。结果表明，静电纺丝可以有效地将DOTAP/siRNA复合物封装在PVA纳米纤维中。即使直接将每种组分添加到PVA溶液中，绕过DOTAP/siRNA复合物制备过程，也可以观察到对荧光素酶表达的稳定抑制。此外，PVA纳米纤维释放的DOTAP/siRNA复合物表面含有PVA残基，这表明PVA的性质可能影响复合物与细胞之间的相互作用。因此，水解和聚合的程度，或PVA的等级，影响荧光素酶的表达抑制，低水解度的PVA观察到更高的RNAi活性。尽管携带电荷的改性PVA目前尚未被批准作为药物辅料，但对荧光素酶表达的强烈抑制表明，将带电聚合物与PVA混合可能会产生更有效的纳米纤维，用于将核酸药物输送到细胞中。

图1.PVA （EG-40P）纳米纤维释放的DOTAP/siRNA复合物对荧光素酶表达和细胞内分布的抑制(a)左边的原理图说明了用BioRender.com创建的含有DOTAP/ sirna的PVA纳米纤维（N/P比= 5）的制备方法。图的右侧显示了不同制备方法对A549-Luc细胞基因表达抑制率的影响。图中柱状图表示平均值±SD （n = 3）。(b) A549-Luc细胞中FITC-PVA和TAMRA-siRNA的胞内分布。用FITC-PVA和TAMRA-siRNA在无血清培养基中与完全溶解的含DOTAP/ sirna的PVA纳米纤维溶液孵育4小时后，拍摄CLSM图像。标尺：10 μm。

图2.扫描电镜（SEM）图像的DOTAP/ sirna含PVA纳米纤维（N/P = 5）使用不同等级的PVA。采用方法a制备PVA纳米纤维。标尺：5 μm。(a) PVA20-88 (EG-30P), (b) PVA6-88 (EG-05P), (c) PVA25-80 (KH-20), (d) PVA17-98 (NH-18), (e)阳离子PVA (K-434), (f)阴离子PVA （T-330）。