一、研究背景：小口径血管移植物的临床困境

引言：心血管疾病全球死亡率居首，血管移植是冠心病与外周动脉疾病的核心治疗手段。然而，直径＜6 mm的小口径血管移植物面临三大瓶颈：

1. 急性血栓形成：低血流动力学导致血小板易聚集，术后24小时血栓发生率超40%；

2. 内膜增生：血流剪切力变化诱发平滑肌异常增殖，6个月通畅率仅30-60%；

3. 机械性能失配：天然血管轴向拉伸强度约1.95-2.4 MPa，而传统合成材料（如ePTFE）刚性过高，易导致吻合口撕裂。

现有技术局限：

• 单层支架：无法模拟血管的力学梯度（内膜柔韧/外膜坚固）；
• 物理吸附肝素：释放不可控，2周内活性丧失＞90%；
• 直接共价肝素化：天然材料（如胶原）表面氨基位点有限，负载量不足（＜6 μg/cm²）。

浙江理工大学郑莹莹教授团队在Springer-Verlag期刊《Applied Physics A》发布小口径血管支架（PLA-COL@PLA-PCL@PCL-GEL）的最新成果。该团队利用多步静电纺丝与壳聚糖-肝素化学交联技术，成功构建兼具优异力学与抗凝性能的三层仿生血管支架，实现5天快速内皮化，为临床小口径血管移植提供了安全有效的新方案。

二、创新亮点：三层协同设计与双功能修饰策略

亮点1：仿生三层电纺结构设计

创新性：

• 多步电纺工艺：通过旋转铜轴接收器（Ø=5 mm）实现精准分层沉积（图1）；
• 材料功能分配：内层胶原（COL）提供细胞识别位点，中层PLA-PCL提升轴向强度（达8.47 MPa），外层明胶（GEL）促进宿主整合。

亮点2：“壳聚糖-肝素”共价级联修饰

突破性策略：

1. 壳聚糖（CS）预沉积：

将支架浸入0.1% CS/醋酸溶液24 h → 0.1 M NaOH固定；

作用：在胶原纤维网络引入额外氨基（-NH₂），位点密度提升2.1倍。

2. EDC/NHS激活肝素：

肝素羧基（-COOH）与EDC/NHS形成活性酯（图2）；

与CS的-NH₂发生酰胺反应，实现共价锚定。

核心优势：

• 肝素负载量跃升：PC21-CHep组达8.57±0.08 μg/cm²（vs. 直接肝素化组6.43 μg/cm²）；
• 稳定性突破：PBS浸泡30天，肝素保留率＞95%（物理吸附组仅剩18%）。
  
  

三、核心实验：从表征到性能验证

实验1：肝素化效率与结构表征

甲苯胺蓝定量（图3）：

标准曲线R²=0.99591，PC21-CHep肝素密度较PC21-Hep提高33.3%；

显色验证（图4）：CS沉积组呈深紫色（高负载），对照组为浅蓝色。

纤维形貌与粗糙度（图5-6）：

机理：肝素与CS交联增大纤维直径，粗糙度提升促进细胞铺展。

FTIR与拉曼光谱（图7）：

• 1160 cm⁻¹处C-N键特征峰增强，证实肝素-壳聚糖共价连接；
• 1656 cm⁻¹（酰胺I带）和1355 cm⁻¹（酰胺III带）显示α-螺旋结构稳定性提升。

实验2：生物学性能

验证内皮细胞增殖：

• CCK-8检测：第5天PC21-CHep组细胞活性达对照组的187.94%（vs. PC21-Hep组143.02%）；
• SEM观察：第5天PC21-CHep组HUVECs完全覆盖支架表面（实现内皮化）。

抗凝血性能：

渗透实验（图15）：CS-Hep组血液保持液态＞30分钟，未修饰组10分钟凝固。

实验3：机械性能优化

轴向拉伸（图9）：

• PC21-CHep最大应力达7.50 MPa（天然血管1.95-2.4 MPa）；
• 初始模量提升至天然血管的1.8倍，避免植入后动脉瘤形成。

径向扩张性：

• 断裂伸长率155-205%，匹配自体血管（40-100%）的动力学需求。
  
  

图文解读

图 1：展示了三层 PLA-COL@PLA-PCL@PCL-GEL 小口径血管支架的制备及其表面肝素化的 schematic diagram，过程包括通过静电纺丝依次制备 PLA-COL 单层、PLA-COL@PLA-PCL 双层、PLA-COL@PLA-PCL@PCL-GEL 三层血管支架，之后进行冷冻干燥，再经浸泡、固定处理、交联反应和冷冻干燥完成血管支架的肝素化。

图 2：为血管支架肝素化原理的 schematic diagram，肝素的羧基（Hep-COOH）在 EDC 和 NHS 作用下被激活，EDC 先与肝素的羧基反应形成不稳定的 O - 酰基异脲中间体，NHS 再与之反应形成半稳定的氨基反应性 NHS 酯，该酯在 pH 7.4 时稳定，支架浸入激活后的肝素溶液后，肝素的羧基与支架内层表面胶原蛋白或沉积的壳聚糖的氨基发生酰胺反应，使肝素接枝到血管支架上，且壳聚糖提供了更多氨基位点，增加了纤维表面接枝的肝素数量。

图 3：a 为添加不同浓度肝素时甲苯胺蓝的吸收光谱，b 为甲苯胺蓝染色法测定肝素浓度的标准曲线，其中吸收度随肝素浓度增加而线性降低，拟合优度 R²=0.99591，表明实验数据与拟合曲线接近，可用于计算不同样品表面的肝素结合密度。

 

图 4：(a) 为 PC21 和 PC21-CHep 血管支架经甲苯胺蓝溶液染色后的照片，(b) 为 PC21-Hep 和 PC21-CHep 血管支架经甲苯胺蓝溶液染色后的照片，无肝素结合的 PC21 表面呈蓝色，接枝肝素的 PC21-CHep 呈紫色，且未负载壳聚糖的 PC21-Hep 颜色比负载壳聚糖和接枝肝素的 PC21-CHep 浅，染色结果与根据曲线计算的结合密度一致。

 

 

图 5：为 PC21、PC31、PC41、PC21-Hep、PC31-Hep、PC41-Hep、PC21-Chep、PC31-CHep 和 PC41-CHep 内层表面的 SEM 图像，显示了不同支架的纤维形态，其中 PC21、PC31、PC41 的纤维直径分别为 1.07μm、1.01μm、0.83μm，随 PLA 含量增加而减小，接枝肝素后纤维直径略有增加，负载壳聚糖和接枝肝素的支架平均纤维直径更大。

 

图 6：为 PC21、PC21-Hep 和 PC21-CHep 内层的 3D 表面结构及表面粗糙度，PC21 的中线平均粗糙度高度（Ra）为 12.34μm，表面因静电纺丝工艺形成显著多孔结构，接枝肝素后（PC21-Hep）表面粗糙度增加至 14.17μm，负载壳聚糖和接枝肝素的 PC21-CHep 表面粗糙度最大，为 16.33μm。

 

图 7：为不同血管支架的傅里叶变换红外光谱，PC21 在 3200-3440cm⁻¹ 范围内有 N-H 和 O-H 伸缩振动吸收峰，2957cm⁻¹ 和 1066cm⁻¹ 处有 C-H 和 C-O 伸缩振动特征峰；接枝肝素的支架在 3200-3440cm⁻¹ 范围内吸收峰强度显著增强，负载壳聚糖和接枝肝素的支架该范围吸收峰强度更高，且在 1160cm⁻¹ 处吸光度增强，表明壳聚糖的氨基与肝素的羧基结合产生更多 C-N 键，1735cm⁻¹ 处强峰由 C=O 伸缩振动引起，酰胺 I 带（1700-1600cm⁻¹）峰增强表明交联未破坏 α- 螺旋结构反而增强其稳定性。

四、结论与展望：临床转化的路线图

核心结论

三重协同效应：

• 结构仿生：三层电纺模拟血管力学梯度；
• 化修饰：CS预沉积提升肝素负载量33.3%；
• 生物功能：内皮化速度提升至5天全覆盖。

性能突破：

• 抗凝性：凝血时间延长至天然血管的2倍；
• 机械强度：轴向应力达天然血管的3倍；
• 生物安全性：溶血率＜2%（ISO 10993标准要求＜5%）。

临床转化挑战与展望

挑战：

• 降解匹配：PLA/PCL降解周期（6-24月）与组织再生速度的同步调控；
• 动物模型验证：亟免入猪冠状动脉移植实验（＞6个月通畅率测试）。

未来方向：

• 智能化释放：整合VEGF/NO控释系统（如Kabirian et al., 2019）；
• 3D打印定制化：结合患者CT数据打印个体化分支血管（Sun et al., 2024）；
• 原位内皮化：预播种自体干细胞（如EPCs）加速临床转化。

郑盈盈教授展望：“本研究首次将壳聚糖介导的肝素共价锚定与三层仿生设计耦合，为攻克小口径血管移植物血栓难题提供了新范式。下一步将开展大动物实验，推动其成为首个国产化活性血管移植物。

文献来源：https://doi.org/10.1007/s00339-025-08593-w