一、研究背景

骨骼在人体中扮演着许多重要的角色，为肌肉和其他组织提供结构框架，促进运动，保护内部器官免受伤害。由骨肿瘤、骨损伤和其他骨骼疾病引起的大骨缺损往往不能通过人体的自然修复机制自愈。因此，无论是天然的还是合成的骨移植物，都需要用于替换患病或缺失的骨。虽然传统的移植技术是有效的，但它们可能导致手术并发症和不理想的结果。这推动了组织工程解决方案的兴起，特别是骨组织工程，作为有前途的替代方案。

在骨组织工程的发展过程中，利用生物材料结合干细胞构建的支架在体外进行2-3周的骨诱导，然后植入动物骨缺损部位，取得了良好的骨缺损修复效果。静电纺丝技术是骨组织工程组织工程支架的一种常用技术。在静电纺丝过程中，前驱体溶液在高压电场作用下由液滴转变为细纤维。收集的超细纤维形成纤维膜，模拟细胞外基质，为细胞增殖和成骨提供了有利的环境。我们之前的工作已经证实了这一点。尽管电纺丝支架具有显著的优势，但也有其局限性，其中之一是支架内外的种子细胞分布不均匀，导致细胞浸润性差。为了克服这一限制，提出了一种新的方法——电池静电纺丝（CES）。CES是一种基于静电纺丝的技术，它生产的纤维可以嵌入活细胞。CES与传统静电纺丝的主要区别在于使用活细胞，为我们的实验提供了即时的植入条件。

除了制造技术外，生物材料在骨组织工程中也是不可或缺的。生物材料的选择至关重要。聚（3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯）（P34HB）是一种聚羟基烷酸酯衍生物，因其机械稳健性、生物相容性和可生物降解性而脱颖而出。其优越的表面性能进一步增强了其作为支架材料的吸引力。因此，P34HB作为生物活性分子持续释放的载体或可降解的植入材料获得了极大的兴趣。我们的初步研究证实其具有良好的生物相容性、生物可降解性和促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。在本研究中，我们继续使用P34HB开发用于成骨的CES纤维支架。

此外，ASP、β-甘油磷酸钠（GP）和地塞米松（DEX）是成骨细胞诱导培养基中必需的补充物。在体外，抗坏血酸已被证明能促进成骨细胞分化。由于抗坏血酸的强还原性，它在外界环境中的稳定性相对较低。ASP是抗坏血酸的长效衍生物，由于其稳定性好，功能相似，在特定应用中逐渐取代抗坏血酸。在骨基质矿化研究中，甘油三酯作为磷酸基供体。DEX是一种广泛使用的合成糖皮质激素，可促进成骨细胞的分化。然而，关于这三种成分在体内诱导干细胞成骨的报道很少。Wang等人制备了具有抗坏血酸、β-甘油磷酸酯和DEX缓释的赖氨酸二异氰酸酯成骨支架，研究了其对干细胞的体外成骨诱导能力。然而，将这三种诱导成分与CES技术结合，立即植入并探索其体内成骨诱导能力仍未得到探索。在载药电纺丝纤维的研究中，高浓度的药物往往分布在纤维表面，并表现出最初的爆裂释放。核壳喷嘴制备的纳米纤维可以将药物限制在核心层，这有望限制药物在初始阶段的释放。同轴静电纺丝是制备芯-壳纤维的常用方法。通过这种技术，药物可以被包裹在纤维内，并且随着包封率的增加，药物的释放时间可以有效延长。

在这项研究中，我们介绍了一种新型的基于p34hb的光纤缓释系统，该系统使用双喷嘴CES制作。结合核壳喷嘴，该系统将HUCMSCs嵌入装载ASP， GP和DEX的P34HB纤维中，以便立即在体内应用。它持续促进HUCMSCs的成骨分化。

二、摘要

本研究介绍了聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸）（P34HB）超细纤维缓释系统的开发和评价，该系统用于人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）的体内成骨诱导。该系统通过静电纺丝设备利用双喷嘴和细胞静电纺丝技术，将l-抗坏血酸-2-磷酸镁（ASP）、β-甘油磷酸钠和地塞米松（DEX）包裹在纤维中，确保持续的成骨分化。研究了支架的形态、表征、亲水性、力学性能和细胞行为。采用兔即刻皮下植入法观察其异位成骨诱导作用。成功制备了P34HB超细纤维缓释体系。表征证实了支架内HUCMSCs和诱导成分分布均匀，没有化学反应影响活性成分。体外测试显示，DEX和ASP的释放时间较长，而生物相容性测试则突出了支架对细胞生长的适应性。茜素红、I型胶原和骨桥蛋白（OPN）染色证实了支架对HUCMSCs的强效成骨诱导作用。值得注意的是，立即植入新西兰大白兔，在8周内形成了明显的新骨。这些发现强调了该系统无需体外诱导即可立即在体内植入的潜力，标志着骨组织工程的一个有希望的进展。

三、结论

在这项研究中，我们利用双喷嘴和 CES 成功开发出了 P(AGD)-CES 超细纤维缓释系统，无需事先进行体外诱导即可立即植入体内。体外和体内实验均证明，该系统具有促进 HUCMSCs 成骨分化的潜力，这凸显了它作为新型治疗工具的前景。鉴于 P(AGD)-CES 系统的生物仿生属性、机械坚固性、生物相容性和持续释放能力，它为临床治疗骨缺损提供了一种创新方法。本研究的不足之处在于缺乏体内成骨标志物分析和原位成骨评估。后续研究将进一步改进。

图1.光纤缓释体系的形态观察和能量色散x射线分析。含ASP、GP和DEX的P（AGD）纤维的光学显微镜观察(A)、透射电镜(B)和扫描电镜(C)、纯P34HB纤维的扫描电镜(D)、CES纤维慢释体系的扫描电镜(E)、P（AGD）和P34HB的EDX分析及其元素含量（F、G）。白色箭头指向包封在超细纤维中的DEX、ASP和GP。

图2.纤维缓释系统的亲水性测试、体外降解、生物相容性和增殖粘附电镜观察。缓释系统在 0、15 和 30 秒时的接触角（A）、膨胀率（B）、体外降解曲线（C）、CES 第 1 天的细胞存活率（E）、细胞/支架体外培养 7 天和 14 天的细胞增殖（D）、7 天和 14 天的活体/死体染色成像（F）、7 天和 14 天 HUCMSCs 在生物活性纤维膜上的扫描电镜（G）。白色箭头指向包裹在超细纤维中的 DEX、ASP 和 GP，黄色箭头指向干细胞（比例尺：500 μm，20 μm）。*p < 0.1，**p < 0.01。