一、研究背景

皮肤创面愈合是一个复杂的生理过程，涉及多种细胞的增殖和迁移到创面部位。然而，不仅仅是细胞在伤口愈合中起作用。生长因子、细胞因子等代谢产物和离子在愈合过程中也是必需的。参与皮肤创面愈合的主要细胞类型包括角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞。角质形成细胞是表皮中最丰富的细胞类型，而成纤维细胞和内皮细胞则存在于真皮中。在愈合过程的炎症阶段，免疫细胞到达伤口部位并释放化学引诱剂和生长因子。这种趋化剂和生长因子的释放对成纤维细胞和角化细胞的迁移和增殖负责。此外，内皮细胞迁移到伤口部位是确保伤口愈合和形成新毛细血管的重要步骤。在某些情况下，皮肤需要很长时间才能愈合，或者在可归类为慢性伤口的情况下，不愈合。慢性伤口包括压疮、腿部静脉溃疡、动脉溃疡、神经营养性溃疡和糖尿病患者的足部溃疡慢性伤口的患病率随着血管疾病、糖尿病或高龄而增加。据估计，1-2%的人口在其一生中会经历一次慢性伤口，具体来说，15%的2型糖尿病患者会发生溃疡。

慢性伤口的特点是细胞因子的失衡和伤口部位生长因子的减少。此外，由于缺乏化学引诱剂和生长因子，皮肤驻留细胞的增殖和迁移显著减少。因此，添加生长因子和其他蛋白质和离子可以促进伤口愈合。血小板衍生物，如富血小板血浆、血小板凝胶或血小板裂解液（PL），由于其生物活性化合物含量高，可用于治疗方法血小板衍生物的成分包括凝血因子、血管活性因子和生长因子人PL是一种潜在的治疗工具，它富含多种生长因子，在角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞的迁移和分化中发挥重要作用。这些因子包括血小板衍生生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等使用PL作为一种改善慢性伤口愈合的治疗方法可以与开发新的伤口敷料或皮肤支架相结合。

在目前正在开发的用于皮肤组织工程的材料中，纳米纤维层显示出很大的前景。纳米纤维结构类似于天然皮肤细胞外基质，确保了高孔隙率和高表面体积比。这些特殊的材料特性已被证明可以改善细胞粘附和增殖，减少病原体渗透，并有助于在愈合过程中提供潮湿的环境。静电纺丝是制备医用纳米纤维材料最成功的方法之一。其优点之一是可以使用广泛的天然和合成聚合物从聚合物溶液中制备材料。与其他技术相结合，甚至可以生产出大的均匀层，并且可以用作药物输送系统除了聚合物的选择，材料的形态也会受到用于生产的技术及其工艺参数的影响。具有小纤维直径的平面纳米纤维层特别适用于慢性和急性伤口的治疗除了纳米纤维结构外，纳米纤维膜还可以使用促进伤口愈合的生物活性化合物（如生长因子）进一步功能化。对于伤口敷料，使用生物可降解聚合物可能是有利的，脂肪族聚酯（例如聚己内酯）是最常用的。由可生物降解聚酯制成的纳米纤维材料降解缓慢，因此对细胞的机械支持可以在所需的时间内保持稳定。相反，大多数聚酯是疏水性的，生产时必须使用腐蚀性有机溶剂。因此，直接掺入敏感的生物活性蛋白是有问题的。因此，使用水溶性聚合物（例如聚乙烯醇）来制备纳米纤维是有利的，这些纳米纤维与蛋白质结合在一起，可确保其活性损失最小。相反，所得到的材料可溶于水环境，因此所结合的分子很快被释放出来，材料的纤维结构丢失了。此外，这些材料的强亲水性不太适合细胞增殖。因此，使用一种结合聚酯纤维良好机械性能优点的材料可能是有益的，聚酯纤维的疏水性将通过含有生长因子的亲水性成分的存在而降低。在这方面，结合亲水和疏水聚合物纤维的纳米纤维材料的静电纺丝需要特殊的方法。特殊的静电纺丝装置使用两个或多个不同排列的纺丝电极来制造这些材料。多喷流静电纺丝提供了同时纺丝几种聚合物的可能性，从而制造出一种包含这些聚合物的纳米纤维混合物的材料。事实上，无针静电纺丝减少了广泛使用的多针静电纺丝产生的相邻射流之间不必要的相互作用。聚乙烯醇（PVA）和聚己内酯（PCL）纳米纤维的组合到目前为止只以几层的形式出现，是用针静电纺丝在旋转的圆柱形集热器上从一个喷嘴连续或同时从两个喷嘴制造的——双射流静电纺丝。这种针静电纺丝需要一个小时或更长时间来制备几平方厘米大小的样品。如本文所述，使用半操作设备的无针方法可以生产出更均匀的纳米纤维层，生产率更高，从而有可能生产出更大的样品。

本研究采用可生物降解的疏水聚酯PCL。 PCL显示出适合用于皮肤组织工程的性能，并已获得食品和药物管理局（FDA）的批准。水溶性聚乙烯醇，用于皮肤组织工程，特别是以水凝胶的形式，被选为第二种聚合物，是一种适合于蛋白质掺入的聚合物。在我们之前的工作中，我们使用高度水解的PVA制备了含有血小板生长因子的大规模纳米纤维层，这些蛋白的释放时间延长，对皮肤细胞有有益的影响。在这里，将PL掺入PVA中，得到含有PL （PCL-PVA + PL）和不含PL （PCL-PVA）的PCL和PVA多层纳米纤维膜。制备的膜含有PCL，允许细胞粘附和生长，而PVA作为水凝胶释放生物活性物质。这种新型的双功能纳米纤维膜结合了亲水性和疏水性两种不同的材料，具有有趣的性能，可用于伤口愈合。PCL-PVA + PL膜的作用在体外用参与伤口愈合的三种皮肤细胞（角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞）进行了评估。将这三种细胞类型与膜共同培养，以评估细胞在共同培养时的行为，并提供更真实的体内情况模型。将PCL- pva + PL与不加PL的PCL- pva膜和加了PCL膜的PCL- pva膜的效果进行比较。

二、摘要

皮肤创面愈合是一个复杂的生理过程，涉及多种细胞类型、生长因子、细胞因子和其他生物活性化合物。在这项研究中，开发了一种新型的双功能多层纳米纤维膜用于慢性伤口。该膜由五层聚己内酯（PCL）和聚乙烯醇（PVA）纳米纤维（PCL-PVA）交替组成，具有双重功能：PCL纳米纤维层允许细胞粘附和生长，而富含血小板裂解物的PVA层（PCL-PVA + PL）作为药物传递系统，将生物活性化合物从PL连续释放到水环境中。该材料采用无针多射流静电纺丝设备方法生产，可实现均匀的大规模生产。具有生物活性的PCL-PVA + PL膜具有细胞相容性和血液相容性。三种参与伤口愈合的细胞类型（角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞）的空间区室共培养用于细胞相容性研究。PCL-PVA + PL膜增强了所有细胞类型的增殖，并增加了成纤维细胞和内皮细胞的迁移。这些膜也具有血液相容性，对血栓形成、溶血和凝血没有任何有害影响。因此，PCL-PVA + PL膜的有益作用在体外得到证实，使其成为治疗慢性伤口的有希望的支架。

三、结论

一种由PCL和PVA交替组成并允许PL掺入的多层纳米纤维膜已被开发为一种很有前途的皮肤伤口愈合支架。材料的生产采用了原始的多喷嘴无针静电纺丝方法。可生物降解的PCL表现出适合细胞附着和生长的特性，水溶性PVA允许PL的掺入。多层纳米纤维膜作为药物传递系统，释放有效浓度的PL中存在的生物活性化合物。不含聚乳酸的多层膜（PCL- pva），特别是含聚乳酸的多层膜（PCL- pva + PL）与聚乳酸相比，具有更好的润湿性和吸水性，这对于体外和体内应用都是重要的。

多层纳米纤维膜表现出血液相容性和细胞相容性，对溶血和凝血没有有害影响，对角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞的细胞粘附和增殖也没有有害影响。建立了三种细胞类型和纳米纤维膜的共培养系统，在膜的两侧生长角化细胞和成纤维细胞，模拟皮肤的基底膜。空间区隔使得研究细胞类型之间的旁分泌相互作用成为可能。

与PCL-PVA膜相比，PCL-PVA + PL膜的生物活性可以通过增加细胞的增殖/细胞代谢活性来证明，而成纤维细胞的表型成熟可以通过I型胶原的产生来证明。此外，PCL-PVA + PL膜的存在增强了成纤维细胞和内皮细胞的迁移。因此，PCL-PVA + PL多层纳米纤维膜对参与伤口愈合的三种细胞的有益作用在体外得到了证实，该膜具有治疗慢性伤口的潜力。

图1.测试材料的静电纺丝：(a)用一个固定丝纺丝电极进行无针直流（DC）静电纺丝的方案——生产单层材料；(b)两个固定丝纺丝电极无针直流电纺丝的正面图——双层材料的生产；(c)两个固定丝纺丝电极的静电纺丝装置内腔照片和(d) PVA和PCL复合的最终五层材料的三步生产方案。单个部件是：1 -连接到高直流电压正源的旋转电极；2 -线式集电极连接到负电源的高直流电压；3 -将形成的纳米纤维层或双层放置在ESI上；4 -将聚合物溶液应用于固定导线旋转电极的可移动迷你储层（载体）。

图2.电纺丝材料的代表性SEM显微照片和相应的纤维直径分布（n = 360）： PCL (A)、PCL- pva (B)和PCL- pva + PL (C)。比例尺10 μm。