2024年8月12日，上海交通大学附属第九医院林开利教授团队,在《Nano Energy》发表了“Synergistic effect of electrophysiological microenvironment and bioactiveions for enhancing bone regeneration”。本研究旨在利用同轴电纺技术，开发出一种新型植入式电气化支架，通过电生理微环境和生物活性离子的协同作用，显著提升骨再生效率。
一、研究背景
骨创伤缺陷治疗是骨科领域的一大挑战，尽管目前有多种治疗方法，但均存在局限性，如自体骨移植的供体部位并发症和外来骨创伤缺陷治疗是骨科领域的一大挑战，尽管目前有多种治疗方法，但均存在局限性，如自体骨移植的供体部位并发症和外来材料的免疫排斥问题。本研究旨在开发一种新型的同轴电纺丝技术制造的可植入驻极体支架，以模拟天然骨的电生理特性和生物活性元素，通过电刺激和生物活性离子的协同效应促进骨再生。该方法有望克服现有技术的局限，为骨缺损治疗提供一种创新的解决方案。
二、研究方法
采用同轴电纺技术构建一种核壳结构的植入式电极支架。核层由聚己内酯/二氧化硅(PCL/SiO+)电晕材料组成，壳层由聚己内酯/硅酸钙纳米线(PCL/CSNs)构成。通过电纺丝过程中壳层的降解持续释放生物活性离子，同时核层提供的内源性电刺激，共同促进成骨分化，实现骨再生。
图1 同轴电纺丝纤维膜的示意图，通过生物活性离子和电刺激的协同结果促进了骨修复的过程。
三、研究过程
材料表征：通过水热合成法制备的硅酸钙纳米线（CSNs）呈现出大约20纳米的直径及几微米的长度，其X射线衍射（XRD）图谱的特征峰与斜方辉石相的特征相吻合，揭示了其明确的晶体结构。进一步利用共轴静电纺丝技术，研究团队将这些CSNs与二氧化硅（SiO2）电介质一同封装于聚己内酯（PCL）基质之中，构建出核壳结构的纤维膜，其特定比例经过精确调控。扫描电子显微镜（SEM）图像和能量色散谱（EDS）图谱共同证实了纤维膜中SiO2和CSNs的均匀分布与成功掺杂，展现出纤维直径的一致性及元素的均匀分布。
图2 具有不同二氧化硅比值的同轴静电纺丝支架的制备与表征。(A)二氧化硅的透射电镜图像。二氧化硅的(B) XRD模式。二氧化硅的(C) FITR分析。不同SiO2比值下同轴静电纺丝支架的(D) SEM图像和EDS映射。(E)不同二氧化硅比值下同轴电纺丝支架的直径分布。(F)4套支架的FITR分析。
体外实验：通过CCK-8实验评估了不同SiO2比例的电纺纤维膜对骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖的影响，发现2% SiO2比例的纤维膜在第5天时细胞增殖率显著高于其他比例。ALP染色和半定量分析进一步证实了2% SiO2比例的纤维膜在促进BMSCs成骨分化方面的优势。此外，免疫荧光染色分析揭示了电刺激通过CaM/CaN/NFAT信号通路促进成骨分化的分子机制。
图3 具有不同二氧化硅电旋率的同轴电纺丝支架的体外生物合成率和成骨能力。(A)通过CCK-8检测来评估这些支架对骨髓间充质干细胞增殖的影响。星号（*）表示用Tukey‘s test的单向方差分析计算出的符号差异（**p<0.01）。(B)不同二氧化硅比值的同轴电纺丝支架对骨髓间充质干细胞ALP表达的影响。
通过ALP染色，观察到PSPC (极化)组在第4天和第7天展现出了最强的染色效果，这表明该组电纺支架具有最佳的成骨诱导效果。此外，通过定量PCR技术检测关键成骨基因BMP-2、OPN、RUNX2的表达水平，进一步证实了PSPC (极化)组在促进BMSCs成骨分化方面的优势。免疫荧光染色结果同样显示，PSPC (极化)组的BMP-2蛋白表达最为丰富，与ALP染色和基因表达结果相一致。这些体外实验结果为后续体内实验提供了坚实的基础，共同支持了CSNs-SiO2 CEFMs作为一种新型骨修复材料的潜力，其通过持续释放的钙和硅离子以及稳定的电刺激，有效促进了BMSCs的成骨分化，为骨组织工程提供了新的思路。
图4 CSNs-二氧化硅CEFMs对成骨的影响。第4天和第7天CEFMs共培养骨髓间充质干细胞的(A)ALP染色。(B)第4天和第7天共培养的半定量。PP、PPC、PSP（极化）和PSPC（极化）同轴电纺丝支架对骨表现的影响骨髓间充质干细胞的成骨基因：BMP-2(C)，OPN(D)，RUNX2(E)。(F)PP、PPC、PSP（极化）和PSPC（极化）同轴电纺丝支架在BMP-2上的影响在骨髓间充质干细胞中的表达：BMP-2的免疫荧光染色。(G)核壳结构鞘降解引起的钙和硅离子的持续释放说明了csns-sio2cefm的机制。已创建的withBioRender.com。星号（*）表示通过Tukey检验的单向方差分析计算出的显著差异（*p<0.05），（**p<0.01），（***p<0.001）。
体内实验：通过将制备的CSNs-SiO2 CEFMs（核壳结构的导电电纺纤维膜）植入具有5毫米直径颅骨缺损的Sprague-Dawley大鼠模型中，来评估其成骨效果。在手术后的8周内，研究人员对大鼠进行了仔细的观察和监测，以确保实验的顺利进行。通过微计算机断层扫描（micro-CT）和组织学染色（如Van Gieson's染色）等技术，研究人员能够详细评估新骨形成的情况。结果显示，与空白对照组和单一材料组相比，含有CSNs和SiO2的电纺支架组别在新骨体积和骨缺损修复方面表现出显著的改善，尤其是经过极化的PSPC组，其新骨形成几乎完全填满了骨缺损区域。
图5 在大鼠颅骨缺损模型上对 CEFMs 成骨特性的体内评估。(A) CEFMs 体内植入的示意图(B) 代表性的微型计算机断层扫描（micro-CT）图像。(C-D) 新骨体积和新骨总面积比（%）的定量分析。(E) 树脂切片的代表性 Van Gieson（VG）染色图像。星号 (*) 表示通过单因素方差分析（ANOVA）和 Tukey 测试计算得出的显著性差异（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。
电纺纤维膜骨再生的有效特性：全面表征了共轴电纺纤维膜的物理化学和生物学特性，包括通过水接触角测试优化的亲水性、机械性能测试显示的适宜机械强度、可控的生物降解率、持续的钙和硅离子释放、稳定的表面电位以及促进骨髓间充质干细胞增殖的能力，这些特性共同突显了该材料在骨组织工程中应用的潜力，尤其是在促进骨再生和修复方面。
图6 (A)CEFM 的表征和生物相容性评价。（A）CEFMs 的水接触角及其定量分析（B）。机械性能CEFM：拉伸强度 （C）、杨氏模量 （D）。（E） CEFM 的降解率。分别在第 0 周、第 1 周、第 2 周和第 3 周测量样品。（F） 钙离子和 （G） CEFM 在 PBS 中浸泡 1 天、3 天、5 天、7 天和 14 天后释放的硅离子。（H） CEFM 的表面电位。样本是在 0.1 小时、 6 小时、12 小时、 24 小时、3 天、7 天、14 天、 21 天和 28 天测量。（I） PP、PPC、PSP（极化）和 PSPC（极化）同轴静电纺丝的影响BMSCs 增殖的支架：CCK-8。星号 （*） 表示通过单因素方差分析计算的显著性差异 （*p<0.05）、（**p<0.01）、（***p<0.001）Tukey 检验 “ns” 表示无显著差异
电生理微环境与生物活性离子的协同作用：电纺丝纤维膜内核层的二氧化硅(SiO2 )电气材料在无需外部电源的情况下，通过模拟骨组织的电生理微环境，激活了CaM/CaN/NFAT信号通路，从而促进了成骨细胞的分化和功能。同时，外壳层持续释放的钙和硅等生物活性离子直接参与骨基质的形成和矿化，进一步增强了成骨作用。再通过动物模型的颅骨缺损修复实验，利用显微CT成像和组织学染色（图5），直观地证实了这种协同作用在体内环境中促进新骨形成和加速骨缺损修复的有效性。这些结果表明，电生理微环境的模拟与生物活性离子的有序释放相结合，为骨组织工程提供了一种高效且创新的治疗策略。
图7来自 CSNs-SiO2 CEFMs 的电刺激通过 CaM/CaN/NFAT5 通路促进成骨。（A） 免疫荧光在不同 CEFM 上共培养的 BMSC 上的 Ca2 + 染色。（B） Ca2 + 信号转导通路的代表性蛋白质印迹。（C） 简要说明CEFMs 纤维内层极化SiO2 驻极体的电刺激通过 Ca2+ 的流入增强成骨的机制，激活 CaM/CaN/NFAT 信号通路
综上所述，同轴电纺纤维膜（CEFMs）通过模拟骨组织的电生理微环境和持续释放生物活性离子，在促进骨细胞增殖和分化方面展现出显著效果，尤其在大鼠颅骨缺损模型中的高效骨修复能力，为其在临床骨缺损治疗中的应用提供了有力支持。未来研究将着眼于材料性能的进一步优化、作用机制的深入探究、临床应用的广泛验证，以及在其他组织工程领域的潜在应用，将这一创新材料转化为促进骨和其他组织修复与再生的有效临床工具。
论文链接：https://doi.org/10.1016/j.nanoen.2024.110113
