一、研究背景

角膜必须保持透明，以确保视力清晰。角膜由五层组成：三层充满细胞，两层主要由蛋白质构成。角膜内皮层是角膜的最内层，由单层角膜内皮细胞（CEC）组成，细胞密度很高。它固定在厚度约为 10 微米的德斯梅特膜（DM）上。人类的 CECs 本身无法在体内增殖，因此在细胞丢失的情况下无法再生。CECs 的首要作用是从前房输送营养物质，同时维持精确的水合水平，从而保持角膜的厚度和透明度。这一功能的中断会导致角膜造口和表面上皮水肿。鉴于全球角膜捐献的稀缺性，目前仍迫切需要开发培养 CEC 移植方法。目前移植 CECs 的方法包括直接注射和在制作好的载体上移植薄片，模仿 DMEK 移植手术。直接注射细胞的优点是不需要额外材料，可最大限度地减少免疫反应。虽然细胞直接注射法在临床试验中显示出良好的效果，但目前尚未获得美国食品及药物管理局的批准，也未广泛用于患者。目前仍然需要开发移植方法，以克服全球移植组织严重短缺的问题。要做到这一点，就必须创造一种免疫原性极低的瞬时载体，将细胞输送到角膜内部。用于这一目的的材料应薄而柔韧，便于在手术过程中滚动和折叠，多孔，便于渗透，具有适合手术操作的机械性能，并且透明。

利用静电纺丝设备电纺丝是制造高渗透性薄膜的最有价值的工具之一。它能够制造各种形式的纳米纤维支架，并已被积极应用于组织工程领域，特别是伤口愈合、血管移植和心脏组织工程。在 DMEK 角膜移植手术中，先将 7 至 8 毫米的德斯密特膜圆盘和附着的内皮细胞卷成圆筒状，然后通过 2.4 至 4.0 毫米的切口注入前房。然后展开移植移植片，将内皮朝下妥善放置，再借助气泡粘附到后角膜上。目前，角膜外科医生成功采用了 DMEK 技术，内皮细胞损失极少。要在培养的 CECs 上复制这一过程，工程膜必须正确模拟 Descemet 膜。主要使用高生物相容性天然聚合物开发的载体往往会在细胞培养过程中失去机械特性，因此不适合移植。

在本研究中，我们旨在通过将明胶溶液电纺成纳米纤维膜，开发一种用于 CEC 移植的载体。明胶源自胶原蛋白，利用其显著的生物相容性，已被应用于伤口愈合和骨再生等多个领域。此外，明胶还具有有利于电纺丝的特性，如在非有机溶剂中的高溶解性。这种特性不仅能减轻毒性，还能在制备电纺丝溶液时方便地改变溶剂。我们的目标是通过减少其他合成聚合物和有机溶剂的使用，最大限度地降低毒性和免疫反应。gelNF 膜已在多个领域得到应用，但为了获得更强的性能，它们通常与各种合成聚合物混合使用。为了解决与使用有机溶剂相关的透明度和毒性问题，我们试图探索电纺凝胶纳米纤维膜作为 CEC 移植载体的潜在用途。通过将人类和兔子的 CEC 移植到制造好的凝胶 NF 膜上确认蛋白质表达后，我们进行了体外测试，以验证将细胞移植到新鲜采集的兔子角膜上的效果。

二、摘要

角膜内皮由密集的角膜内皮细胞（CEC）组成，附着在德斯梅特膜（DM）上，通过调节水和离子的流动，在维持角膜透明度方面发挥着至关重要的作用。角膜内皮细胞在体内的再生能力有限，而且全球缺乏供体角膜来替代受损的角膜内皮细胞。开发一种培养 CECs 的载体可以满足这一全球性的临床需求。在这项研究中，我们利用电纺丝设备成功制造了明胶纳米纤维膜（gelNF 膜），然后用戊二醛（GA）进行交联。与玻璃相比，制造出的凝胶纳米纤维膜的透明度约为 80%，厚度保持在 20 微米。对于 Descemet 膜类似物来说，凝胶NF 膜具有理想的渗透性和降解性。重要的是，在凝胶无纺布膜上高密度培养的 CECs 没有显示出细胞毒性效应，而且关键的 CEC 功能生物标志物的表达也得到了验证。为了评估这种凝胶NF膜作为培养的CEC移植载体的潜力，我们用它在兔子眼睛上进行了戴斯麦膜内皮角膜移植术（DMEK）。结果表明，这种凝胶NF膜有望成为培养CEC移植的合适载体，它在透明度、渗透性和成功移植所需的足够机械性能方面都具有优势。

三、结论

本研究的目的是开发一种用于移植培养的 CECs 的材料。我们利用电纺丝技术开发了一种凝胶无纺布膜，它能保持足够的厚度、透明度和通透性，以保证角膜的正常功能。我们还证实，在凝胶无纺布膜上生长的 CECs 能表达 ZO-1 等功能性生物标记物。此外，通过体外研究，我们还验证了在凝胶无纺布膜上培养的角膜营养细胞具有适合移植的特性，并能成功粘附在角膜上。因此，gelNF 膜具有作为培养 CEC 移植材料的潜力。

图1.根据凝胶纳米纤维膜的厚度和透明度优化纺丝时间和交联时间。(A) 不同纺丝和交联时间下凝胶纳米纤维膜的宏观图像。图像右上角的数字表示斜线左边的纺丝时间和斜线右边的交联时间。右上角的数字表示旋转时间/GA 交联时间。(B) 不同纺丝时间和交联时间下凝胶纳米纤维膜的透明度测量值与波长的函数关系。

图2.凝胶纳米纤维膜的纳米纤维直径和机械性能分析。(A) GA 交联前后凝胶纳米纤维膜的扫描电镜图像和 (B) 纳米纤维直径的计算结果。(C) gelNF 膜的拉伸应力测试及弹性模量、断裂伸长率和极限拉伸强度的计算结果。ns = 无显著差异，**** = 有显著差异。

图3.凝胶NF 膜的渗透性和降解性。(A) 使用 FITC-葡聚糖和细胞插入物对凝胶NF 膜进行渗透性测试。(B) 测量凝胶NF 膜的渗透性随培养时间的变化。第 0 天刻度线： 第 0 天刻度线：40 微米，第 14 天刻度线：10 微米： 10 微米。(C) 利用厚度变化测量凝胶NF 膜的降解情况。** = 显著差异。